4 ledna, 2022

PMC

Arthur Kornberg zemřel 26. října 2007. Byl jedním z nejpozoruhodnějších vědců naší doby. Jeho objev DNA polymerázy I (Bessman et al. 1958; Lehman et al. 1958a) a jeho demonstrace, že věrně kopíruje základní sekvenci řetězce templátové DNA (Lehman et al. 1958b) vedl k tomu, že mu byla v roce 1959 udělena Nobelova cena. Dříve převládal názor, že enzymy fungují při řízení buněčného metabolismu a při výrobě energie, kterou buňka potřebuje, zatímco syntéza DNA je součástí tajemství života. V sympoziu Cold Spring Harbor o struktuře DNA (Watson and Crick 1953) autoři uvedli: „není nám zřejmé, zda by k provedení polymerace byl vyžadován speciální enzym nebo zda by stávající spirálový jediný řetězec mohl účinně působit jako enzym.“Arthurova práce s DNA polymerázou změnil jsem to všechno, umístil jsem samoreplikaci genů na stejnou biochemickou úroveň s energetickým metabolismem a ukončil vitalismus. Jeho objev zahájil novou zlatou horečku a ukázal cestu, jak se vědci snažili najít enzymy, jako je RNA polymeráza, který kopíruje sekvenci řetězce DNA do RNA, a restrikční enzymy, které se ukázaly jako specifické endonukleázy DNA.

Arthur se narodil 3. března 1918. Pocházel z dělnické rodiny židovských přistěhovalců. Jeho otec neměl žádné formální vzdělání, ale uměl mluvit nejméně šesti jazyky. Arthur byl předčasný a absolvoval střední školu Abrahama Lincolna v New Yorku ve věku 15 let. Když vystudoval City College of New York ve věku 19 let, získal nejlepší vědecký titul ve své třídě. Na vysoké škole, pracoval večery, víkendy, a svátky prodával Pánské oblečení, a ušetřil dost na to, aby zaplatil za první dva roky lékařské fakulty na univerzitě v Rochesteru.

Arthur popsal svůj příběh a jeho náhodný vstup do výzkumné práce v kapitole roční recenze (Kornberg 1989a). Jako student medicíny ho zaujalo, že v sobě našel příznaky mírné žloutenky, což se ukázalo jako Gilbertsův syndrom, potíže s metabolizací bilirubinu. Jeho článek popisující průzkum lidí s touto mírnou metabolickou poruchou četl Rolla Dyer, ředitel National Institutes of Health (NIH), což vedlo k jeho odvolání k NIH z námořní služby ve veřejné zdravotní službě v 1942. Arthurův první výzkum zahrnoval hledání chybějících nutričních faktorů v syntetické stravě krmené potkany. V roce 1946 se Severem Ochoou na Newyorské univerzitě konvertoval k hledání enzymů. Stal se vášnivým zastáncem používání enzymů k dekonstrukci fungování buněk. Jeho krédo bylo jednoduché a pozitivní: „pokud to dokáže buňka, pak to dokáže biochemik a já to dokážu.“Jeho kniha o jeho vědecké kariéře byla pojmenována“ pro lásku k enzymům „(Kornberg 1989b) a napsal pokyny pro začátečníky o „Desateru“ používání enzymů k pitvě biologických procesů (Kornberg 2000).

Arthur měl velící přítomnost; když něco řekl, lidé poslouchali. Vzpomínám si na příběh Arthura, který mluvil na kongresovém slyšení. Po slyšení byl jeden člen výboru překvapen, když zjistil, že jiný člen změnil svůj hlas, a zeptal se ho, proč to udělal. „Nechci, aby mě Arthur Kornberg nazval bláznem“, zněla odpověď. Dan Koshland, dlouholetý přítel Arthura, mluvil na akci, kterou Arthur uspořádal. Začal tím, že řekl: „nikdy neříkám“ ne “ Arthuru Kornbergovi.“Na druhou stranu, Arthur by vás okamžitě uklidnil v osobním rozhovoru. Poznamenal přítel, “ dal vám pocit, že se celá jeho pozornost soustředila na vás.“.“

jednou z mnoha Arthurových pozoruhodných schopností bylo budování oddělení. Opustil NIH v roce 1953, aby se stal předsedou nového oddělení mikrobiologie na Washingtonské univerzitě v St. Louis, kde byl kdysi krátce postdoktorandem s Carlem a Gertym Corim. Arthur je velmi obdivoval (Kornberg 2005) a Vyhlídka na obnovení kontaktu byla silným lákadlem. Jedním z jeho prvních významných jmenování byl Melvin Cohn, který strávil několik let v Institutu Pasteur v Paříži a pracoval s Jacquesem Monodem na rozmotání příběhu indukované syntézy enzymů v Escherichia coli. Mel měl silné zázemí v imunologii od své rané práce s A. M. Pappenheimerem Jr. a v St. Louis začal studovat syntézu protilátek v jednotlivých buňkách. Ostatní členové oddělení v St. Louis, který by se později přestěhoval do Stanfordu s Arthurem, byli Paul Berg a Bob Lehman, kteří byli postdoktorandi s Arthurem, a Dave Hogness a Dale Kaiser,kteří oba pocházeli z Institutu Pasteur.

když byl Arthur nabídnut předsedovi biochemie na Stanfordu v roce 1958, neřekl Ano, ale neřekl ne. Místo toho odpověděl: „musím se vrátit do St. Louis, abych se poradil se svými kolegy.“Příležitostí pro vytvoření nového oddělení biochemie byl přesun Stanfordské lékařské školy ze San Franciska do hlavního kampusu Stanford poblíž Palo Alto. Stanford také jmenoval Joshua Lederberg jako předseda nového genetického oddělení; jeho kancelář ve Stanfordu by byla blízko Arthurovy. když se oddělení v St. Louis přestěhovalo do Stanfordu v červnu 1959, připojil jsem se k němu jako fyzikální biochemik pocházející z University of Wisconsin.

nová věda molekulární biologie právě vznikla v roce 1959 a úroveň vzrušení v našem oddělení byla intenzivní. Centrální dogma, DNA dělá RNA dělá proteiny, byl široce přijímán, ale mnoho z biochemických kroků byly záhady. V St. Louis, Paul Berg začal studovat enzym-aminoacyl adenyláty, které jsou meziprodukty při syntéze aminoacyl tRNA (Berg 1961), a Paul pokračoval v analýze kroků syntézy proteinů. Arthurova práce na enzymatické syntéze DNA ukázala nutnost charakterizovat nukleázy E.coli, enzymy, které degradují DNA, a Bob Lehman začal tuto práci v St. Louis. Dave Hogness a Dale Kaiser provedli studii bakteriofága lambda jako model toho, jak malý genom prochází svým životním cyklem. Vyvíjeli metody pro provedení této studie na hladinách DNA a mRNA. Dva postdoktorandi z Austrálie, Ross Inman a Gerry Wake, připojil se ke mně ve snaze otestovat, zda nově syntetizovaná DNA vyrobená Pol I zůstává spárována se svým templátovým vláknem, pomocí křivek tání DNA k rozlišení dvojitých šroubovice, které obsahují 5-bromuracil V jednom vlákně.

Arthur pečlivě přemýšlel o podrobnostech organizace oddělení a jeho usazení do života lékařské fakulty a univerzity. Jeho plánem bylo vytvořit ideální pracoviště. Výzkumné skupiny by vzájemně spolupracovaly a nic by nezasahovalo do výzkumu, i když se katedra pyšnila výukou svého populárního kurzu obecné biochemie. Arthur někdy diskutoval s Wallace Sterlingem, prezidentem Stanfordu, o jeho představách o tom, jak by se lékařská věda měla rozvíjet na Stanfordu. Dvakrát pozval prezidenta Sterlinga na neformální oběd s biochemickou fakultou, abychom ho také poznali.

zde jsou některé z inovací, které Arthur provedl, když oddělení začalo v roce 1959. Studenti a postdoktorandi byli smícháni ve společných laboratořích, aby se různé výzkumné skupiny navzájem seznámily s výzkumnou prací. Vzácné enzymy byly sdíleny a hlavní nástroje byly zpřístupněny všem. Výzkumné granty byly sdíleny. Od každého člena fakulty se očekávalo, že přinese částku vynaloženou jeho skupinou, ale nebylo vyžadováno přísné účetnictví a neexistovaly žádné finanční lhůty. Celé oddělení se zúčastnilo seminářů úterý/čtvrtek poledne. Nejprve, přednášeli pouze členové fakulty a hostující vědci, ale později se přidali postdoktorandi a starší studenti. Oddělení přijalo každý rok pouze čtyři nové studenty na sedmičlennou fakultu, a potenciální studenti byli přísně prověřováni. Mnoho z prvních studentů se stalo známými vědci. Velikosti skupin byly malé. Členové fakulty pracovali v laboratoři sami a učili studenty učňovskou metodou. Schůze fakulty se konaly pouze tehdy,když bylo něco důležitého rozhodnout; Arthur sám učinil menší rozhodnutí. O otázkách se rozhodovalo na zasedáních fakulty na základě konsensu; jakmile byla otázka projednána, nebylo třeba hlasovat. Jak to všechno fungovalo v praxi? Báječně, podle postdoktorandů, kteří, když začali nová zaměstnání a odešli, toužebně si vzpomněli na své dny ve Stanfordu.

z původních sedmi členů fakulty zůstal jen jeden. V roce 1959 jsem cítil napětí mezi Arthurem a Mel Cohnem ohledně toho, jak řešit biologické problémy. Mel nadšeně hovořil o biologii Gestalt, o názoru, že člověk nemůže pochopit biologický problém tím, že ho rozdělí na části. Arthur obhajoval použití chemie, konkrétně enzymů, jako základního nástroje pro řešení biologických problémů. V roce 1962 Mel Cohn opustil Stanford pro nově vytvořený Salk Institute a v letech 1963-64 se k našemu oddělení připojili Lubert Stryer a George Stark. Brzy dělali inovativní experimenty, zejména vývoj nových metod, které přitahovaly širokou pozornost. Lubertovy experimenty na přenosu fluorescenční energie (Stryer and Haugland 1967) vedly k vývoji pražce (fluorescenční rezonanční přenos energie) jako hlavního biofyzikálního nástroje. George vyvinul široce používané metody pro analýzu transkripčních a translačních experimentů na papíře: Severní metoda (Alwine et al. 1977) pro mRNA a západní metodu (Renart et al. 1979) pro proteiny. Přestože Lubert i Jiří nakonec naše oddělení opustili, udržovali si úzké vazby. V 1971, Ron Davis nastoupil na katedru a, stejně jako původní šest fakulty, nikdy neopustil Stanford. Ron s sebou přinesl elektronovou mikroskopii DNA, mocný nástroj, který byl brzy v oddělení široce používán.

rané Stanfordské biochemické oddělení bylo komunitou, kde všichni sdíleli a radovali se z objevů ostatních. V roce 1959 se celé oddělení shromáždilo v Arthurově domě jeden večer za měsíc, aby poslouchalo nejnovější poznatky jedné výzkumné skupiny. Během několika let, nemohli jsme se všichni vejít do Arthurova obývacího pokoje a zkusili jsme se setkat v místnosti na kampusu Stanford, ale atmosféra nebyla stejná. Poté, v roce 1972, jsme zahájili dvakrát ročně setkání v Asilomaru, trvající několik dní, na kterých hlásily všechny výzkumné skupiny. V té době byl na každém setkání vždy alespoň jeden překvapivý objev.

do roku 1970 byla řešení hlavních problémů, jak DNA vytváří RNA proteiny, jasná alespoň v obrysu a naši členové fakulty přecházeli k novým problémům. Arthur zjistil, že replikace DNA je multienzymovým problémem i v jednoduchých virových systémech, a začal pracovat na podrobných enzymatických mechanismech replikace DNA, nejprve fágů M13 a φx174, poté samotné E. coli. Paul Berg provedl studium zvířecích virů a brzy se zabýval problémy rekombinantní DNA. Bob Lehman začal studovat genetickou rekombinaci na úrovni DNA pomocí enzymatických i genetických nástrojů. Dave Hogness provedl analýzu vývoje v Drosophile na úrovni DNA a mRNA studiem vývojových mutantů, které vytvářejí monstra s extra nohama nebo křídly. Dale Kaiser si vybral bakteriální systém, Myxokok, aby vypracoval genetickou analýzu vývoje v prokaryotickém systému. Dokonce i Arthur testoval vody zkoumání vývoje na enzymatické úrovni pomocí bakteriálních spór jako možného modelového systému. Jeho práce na replikaci DNA však odsunula spory stranou. Začal jsem hledat strukturální meziprodukty ve skládání bílkovin a mechanismu skládání.

dramatický okamžik přišel v roce 1969, kdy John Cairns oznámil, že on a jeho asistent našli životaschopného mutanta E. coli, který postrádá detekovatelnou aktivitu enzymu DNA polymerázy I (De Lucia a Cairns 1969). Brzy následovalo hledání dalších DNA polymeráz. Překvapivě to byl Arthurův syn Tom, který pracoval s Malcolmem Gefterem v Kolumbii, kdo našel nejprve DNA polymerázu II a poté DNA polymerázu III, enzym, který replikuje chromozom E. coli. Příběh shrnuje Arthur ve své vědecké paměti (Kornberg 1989a). Tom byl studentem hudby na Juilliardu a měl před sebou slibnou kariéru violoncellisty. V době, kdy se Cairnsův mutant stal veřejným vědomím, Tom utrpěl zranění ruky, které zasahovalo do hraní na violoncello. Bez formálního výcviku v biochemii se Tom připojil k Gefterově laboratoři a uspěl tam, kde ostatní měli málo štěstí. Další dramatický okamžik nastal v roce 2006, kdy Arthurův nejstarší syn Roger obdržel Nobelovu cenu za chemii za svou práci na molekulární bázi eukaryotické transkripce (Kornberg 2007). Arthurův třetí syn, Ken, je architekt známý svými návrhy vědeckých laboratoří.

zde jsou dva příklady výzkumu, který vzlétl kvůli Arthurově politice míchání výzkumných skupin ve společných laboratořích. V roce 1968, Immo Scheffler, student v mé skupině, který analyzoval přechody spirálové cívky DNA ve spirále vlásenky, sdílel laboratoř s Toto Olivera, postdoktorandem ve skupině Boba Lehmana, který zkoumal enzymatické vlastnosti DNA ligázy E.coli. Toto a Immo zjistili, že ligáza uzavře d (TA)n oligonkleotidy do jednovláknových kruhových molekul (Olivera et al . 1968), pokud jsou dostatečně velké (n = 16 nebo větší). Poté Immo a Elliot Elson, kteří pracovali s Immo na analýze křivek tavení vlásenky, zjistili, že mohou použít kruhové oligonukleotidy, které vytvářejí dvojité šroubovice se čtyřbodovou smyčkou na každém konci, k získání podrobných informací o úloze malých smyček při tavení DNA (Scheffler et al . 1970). Druhým příkladem je Doug Vollrath, student ve skupině Rona Davise, který v roce 1986 sdílel laboratoř s Gil Chu, postdoktorandem ve skupině Paula Berga. Gil má titul Ph.D. ve fyzice z Massachusetts Institute of Technology. Doug se snažil získat lépe vyřešené agarózové gelové vzory pro obří molekuly DNA pomocí nové techniky použití střídavého elektrického pole, které využívá silné závislosti doby přeorientování DNA na molekulové hmotnosti. Gil si uvědomil, že by mohl řešit problém rovných, pravidelných pásem DNA, které jsou dobře vyřešeny řešením rovnic ze základní elektrické teorie. Jeho řešení vyžaduje více elektrod, jejichž napětí lze individuálně regulovat. Výsledkem byly krásně vyřešené vzory pásů DNA (Chu et al . 1986).

jako příklad toho, jak fungovala politika sdílení enzymů, si Dale Kaiser vzpomíná na Arthurův dar v roce 1965 ze dvou vyčištěných enzymů, které umožnily práci z Daleovy laboratoře na kohezivních koncích fágové lambda DNA (Strack a Kaiser 1965). Tyto dva enzymy byly E. coli exo III, která degraduje řetězce DNA z 3 ‚konce, a E. coli DNA pol I, která kopíruje základní sekvenci templátového řetězce syntetizací DNA na 3‘ konci primerového řetězce. Vysoká specifika těchto dvou enzymů jsou důležitá při interpretaci výsledků. Strack a Kaiser měli k dispozici test infekčnosti, který měří schopnost čištěné lambda DNA produkovat fág v E.coli, pokud je přidán také neaktivní pomocný fág. Bylo známo, že vyčištěná lambda DNA má kohezivní místa (Hershey et al. 1963), které fungují při tvorbě DNA dimerů a trimerů. Strack a Kaiser zjistili, že jak exo III, tak Pol I inaktivují lambda DNA, jak bylo testováno testem infekčnosti, a vnitřní genetické markery jsou ztraceny po ošetření enzymem stejnou rychlostí jako vnější markery, což naznačuje, že každý ze dvou enzymů inaktivuje lambda DNA v procesu all-or-none. Jejich výsledky odpovídají modelu, ve kterém visící jednovláknové konce vyčnívají na každém konci dvouvláknové lambda DNA a poskytují soudržná místa nalezená Hersheyem a spolupracovníky (1963). Exo III se postupně degraduje od 3 ‚konce, zatímco pol I používá visící 5‘ konec jako šablonu k prodloužení 3 ‚ konce, dokud nezůstane pouze dvouvláknová DNA, což zabraňuje cirkulaci lambda DNA.

v roce 1990, ve věku 72 let, Arthur zahájil novou oblast výzkumu, enzymatickou syntézu a degradaci polyfosfátu, která zahrnovala zkoumání biologických funkcí polyfosfátu. Arthur a jeho zesnulá manželka Sylvy objevili syntézu polyfosfátů v E. coli již v roce 1956 (Kornberg et al . 1956). Polyfosfát obsahuje vysokoenergetické fosfátové vazby a může být použit k výrobě ATP z AMP. Polyfosfát je tedy skladovací formou rezervní energie pro bakteriální buňky a lze očekávat, že bude hrát zásadní roli v životním cyklu bakterií. Arthur našel četné případy ,ve kterých je to pravda (Kornberg 1999). Zejména u patogenních bakterií je pro virulenci běžně vyžadován polyfosfátový metabolismus.

Arthur byl hrdý na vědecké úspěchy všech výzkumných skupin v našem oddělení a osobně se zajímal o každého, kdo prošel. Mnoho absolventů si velmi dobře uvědomuje roli Arthura při vytváření oddělení skvělým místem pro výzkum. Z mé strany, vím, že hluboko uvnitř to bylo prostředí Stanfordu, které přitahovalo prvotřídní lidi do mé skupiny,a byl to hlavně Arthur, kdo byl zodpovědný.

když Arthur v říjnu zemřel na respirační selhání, bylo mu 89 let a byl nemocný asi jeden týden. Dříve aktivně řídil výzkum polyfosfátu. Stanfordské oddělení biochemie si vzpomnělo na Arthura se 4hodinovým „učením“.“Studenti a fakulty vybrali oblíbené příspěvky z Arthurova seznamu 463 publikací a poskytli krátké shrnutí 5 až 10 minut. Arturovi by se to líbilo.

ROBERT L. BALDWIN
oddělení biochemie, Beckman Center, Stanford Medical Center, Stanford, CA

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.