4 tammikuun, 2022

PMC

Arthur Kornberg kuoli 26.lokakuuta 2007. Hän oli aikamme merkittävimpiä tiedemiehiä. Hänen löytönsä DNA polymeraasi I (Bessman et al. 1958; Lehman ym. 1958a) ja hänen demonstrointi, että se uskollisesti kopioi pohja sekvenssi mallin DNA-juosteen (Lehman et al. 1958b) johti siihen, että hänelle myönnettiin Nobel-palkinto heti vuonna 1959. Aiemmin vallitseva näkemys oli, että entsyymit toimivat solun aineenvaihdunnan ohjaamisessa ja solun tarvitseman energian tuottamisessa, kun taas DNA-synteesi on osa elämän mysteeriä. Cold Spring Harbor Symposium paperi rakenne DNA (Watson and Crick 1953), kirjoittajat totesivat, ”se ei ole selvää meille, onko erityinen entsyymi tarvittaisiin suorittaa polymerointi tai onko olemassa kierteinen yhden ketjun voisi tehokkaasti toimia entsyymi.”Arthurin työ DNA-polymeraasin i kanssa muutti kaiken tämän, asettaen geenien itsereplikaation samalle biokemialliselle perustalle energia-aineenvaihdunnan kanssa ja lopettaen vitalismin. Hänen löytönsä käynnisti uuden kultakuumeen, joka näytti tietä, kun tiedemiehet juoksivat etsimään entsyymejä, kuten RNA polymeraasia, joka kopioi DNA-juosteen sekvenssin RNA: ksi, ja restriktioentsyymejä, jotka osoittautuivat spesifisiksi DNA-endonukleaaseiksi.

Arthur syntyi 3. maaliskuuta 1918. Hän tuli juutalaisesta siirtolaisesta työväenluokkaisesta perheestä. Hänen isällään ei ollut muodollista koulutusta, mutta hän osasi puhua ainakin kuutta kieltä. Arthur oli varhaiskypsä ja valmistui Abraham Lincoln High Schoolista New Yorkissa 15-vuotiaana. Kun hän valmistui 19-vuotiaana City College of New Yorkista, hän sai luokkansa parhaan luonnontieteellisen tutkinnon. Collegessa hän työskenteli iltaisin, viikonloppuisin ja lomilla myyden miesten vaatteita, ja hän säästi sen verran, että maksoi Rochesterin yliopiston lääketieteellisen tiedekunnan kaksi ensimmäistä vuotta.

Arthur on kuvannut tarinaansa ja sattumanvaraista tutkimustyötään vuosittaisessa Reviews-luvussa (Kornberg 1989a). Lääketieteen opiskelijana hän kiinnostui löytäessään itsestään lievän keltataudin oireita, jotka osoittautuivat Gilbertsin oireyhtymäksi, bilirubiinin metaboloitumisvaikeudeksi. Hänen paperin kuvataan tutkimus ihmisiä, joilla on tämä lievä metabolinen häiriö oli lukenut Rolla Dyer, johtaja National Institutes of Health (NIH), ja tämä johti hänen on muistettava, että NIH alkaen meri velvollisuus, Kansanterveyspalvelu vuonna 1942. Arthurin ensimmäinen tutkimus liittyi puuttuvien ravintotekijöiden etsimiseen rotille syötetystä synteettisestä ruokavaliosta. Hän oli muunnettu etsivät sen sijaan entsyymejä, kun tekee tutkijatohtorien työtä vuonna 1946 kanssa Severo Ochoa New Yorkin yliopistossa. Hänestä tuli intohimoinen kannattaja käyttää entsyymejä dekonstruoida miten solut toimivat. Hänen uskontunnustuksensa oli yksinkertainen ja myönteinen: ”jos solu pystyy siihen, niin biokemisti pystyy siihen ja minä pystyn siihen.”Hänen kirjansa hänen tieteellisestä urastaan sai nimen” rakkaudesta entsyymeihin ”(Kornberg 1989b), ja hän kirjoitti ohjeita aloittelijoille” kymmenestä käskystä ” entsyymien käyttämisestä biologisten prosessien leikkelemiseen (Kornberg 2000).

Arthurilla oli komentava läsnäolo; kun hän sanoi jotain, ihmiset kuuntelivat. Muistan tarinan Arthurista puhumassa kongressin kuulemisessa. Kuulemisen jälkeen yksi valiokunnan jäsen yllättyi kuullessaan, että toinen jäsen oli muuttanut ääntään ja kysyi häneltä, miksi hän teki näin. ”En halua, että Arthur Kornberg kutsuu minua narriksi”, kuului vastaus. Dan Koshland, Arthurin pitkäaikainen ystävä, puhui Arthurin järjestämässä tilaisuudessa. Hän aloitti sanomalla ” En koskaan sano ’Ei’ Arthur Kornbergille.”Toisaalta Arthur rauhoitti sinut heti henkilökohtaisessa keskustelussa. Eräs ystävä huomautti: ”hän sai sinut tuntemaan, että hänen koko huomionsa kohdistui sinuun.”

yksi Arthurin monista merkittävistä kyvyistä oli osastonrakennus. Hän jätti NIH: n vuonna 1953 tullakseen uuden mikrobiologian laitoksen puheenjohtajaksi Washington Universityssä, St. Louisissa, jossa hän oli kerran lyhyesti tutkijatohtorina Carl ja Gerty Corin kanssa. Arthur ihaili heitä suuresti (Kornberg 2005), ja yhteyden uusimisen mahdollisuus oli vahva vetovoima. Yksi hänen ensimmäisistä merkittävistä nimityksistään oli Melvin Cohn, joka oli viettänyt useita vuosia Institut Pasteurissa Pariisissa työskennellen Jacques Monodin kanssa selvittääkseen tarinan indusoidusta entsyymisynteesistä Escherichia coli-bakteerissa. Melillä oli vahva tausta immunologiassa hänen varhaisesta työstään A. M. Pappenheimer Jr: n kanssa, ja St. Louisissa hän aloitti vasta-ainesynteesin tutkimuksen yksittäisissä soluissa. Muut St. Louis jotka myöhemmin siirtyä Stanford Arthur olivat Paul Berg ja Bob Lehman, jotka oli tutkijatohtorien fellows Arthur, ja Dave Hogness ja Dale Kaiser, jotka molemmat tulivat Institut Pasteur.

kun Arthurille tarjottiin biokemian oppituolia Stanfordissa vuonna 1958, hän ei vastannut myöntävästi, mutta ei kieltävästi. Sen sijaan hän vastasi: ”Minun täytyy palata St. Louisiin kysymään neuvoa kollegoiltani.”Tilaisuus uuden biokemian osaston muodostamiselle oli Stanfordin lääketieteellisen koulun muutto San Franciscosta Stanfordin pääkampukselle lähelle Palo Altoa. Stanford nimitti myös Joshua Lederbergin uuden genetiikan osaston puheenjohtajaksi; hänen toimistonsa Stanfordissa olisi lähellä Arthurin toimistoa. kun St. Louisin osasto muutti Stanfordiin kesäkuussa 1959, liityin siihen fysikaalisena biokemistinä, joka tuli Wisconsinin yliopistosta.

Uusi molekyylibiologian tiede oli vasta syntymässä vuonna 1959, ja innostus osastollamme oli kova. Keskeinen opinkappale, DNA tekee RNA: sta proteiineja, hyväksyttiin laajalti, mutta monet biokemialliset vaiheet olivat mysteerejä. St. Louis, Paul Berg oli aloittanut tutkimuksen entsyymi-aminoasyyli adenylaatit, jotka ovat välituotteita synteesissä aminoasyyli tRNAs (Berg 1961), ja Paul jatkoi analysoida vaiheita proteiinisynteesiä. Arthurin työ DNA: n entsymaattisen synteesin parissa oli osoittanut tarpeen luonnehtia E. colin nukleaaseja, DNA: ta hajottavia entsyymejä, ja Bob Lehman oli aloittanut tämän työn St. Louisissa. Dave Hogness ja Dale Kaiser olivat ryhtyneet tutkimaan bakteriofagi lambdaa malliksi siitä, miten pieni perimä kulkee elinkaarensa läpi. He kehittivät menetelmiä tutkimuksen tekemiseen DNA-ja mRNA-tasoilla. Kaksi tutkijatohtorin tutkijaa Australiasta, Ross Inman ja Gerry Wake, liittyivät minuun pyrkiessään testaamaan, onko Pol I: n valmistama äskettäin syntetisoitu DNA edelleen emäspari sen mallilangan kanssa käyttämällä DNA: n sulamiskäyriä erottamaan kaksoiskierteet, jotka sisältävät 5-bromourasiilia yhdessä säikeessä.

Arthur mietti tarkkaan yksityiskohtia osaston järjestämisestä sekä sen asettamisesta lääketieteellisen koulun ja yliopiston elämään. Hänen suunnitelmansa oli luoda ihanteellinen työpaikka. Tutkimusryhmät tekisivät yhteistyötä keskenään eikä mikään häiritsisi tutkimusta, vaikka laitos oli ylpeä suositun yleisen biokemian kurssinsa opetuksesta. Arthur keskusteli joskus Stanfordin presidentin Wallace Sterlingin kanssa ajatuksistaan siitä, miten lääketieteen pitäisi kehittyä Stanfordissa. Hän kutsui presidentti Sterlingin kahdesti epäviralliselle lounaalle biokemian tiedekunnan kanssa, jotta me tuntisimme hänetkin.

Tässä muutamia uudistuksia, joita Arthur teki laitoksen aloittaessa vuonna 1959. Opiskelijat ja tutkijatohtorit yhdistettiin yhteisissä laboratorioissa, jotta eri tutkimusryhmät tutustuisivat toistensa tutkimustyöhön. Harvinaisia entsyymejä jaettiin, ja tärkeimmät instrumentit asetettiin kaikkien saataville. Tutkimusapurahoja jaettiin. Jokaisen tiedekunnan jäsenen odotettiin tuovan ryhmänsä käyttämän rahamäärän, mutta tiukkaa kirjanpitoa ei vaadittu eikä taloudellisia määräaikoja ollut. Koko osasto osallistui tiistai / torstai keskipäivällä seminaareihin. Aluksi vain tiedekunnan jäsenet ja vierailevat tutkijat pitivät puheita, mutta myöhemmin tutkijatohtorit fellows ja senior opiskelijat lisättiin. Laitos myönsi vain neljä uutta opiskelijaa vuosittain tiedekunnan seitsemän, ja mahdolliset opiskelijat seulottiin tiukasti. Monista varhaisista opiskelijoista tuli tunnettuja tiedemiehiä. Ryhmäkoot pidettiin pieninä. Tiedekunnan jäsenet työskentelivät itse laboratoriossa ja opettivat opiskelijoita oppipoika-menetelmällä. Tiedekunnan kokoukset pidettiin vain, kun oli jotain tärkeää päättää; Arthur teki vähemmän päätöksiä itse. Asioista päätettiin tiedekunnan kokouksissa yhteisymmärryksessä; kun asiasta oli keskusteltu, ei ollut tarvetta äänestää. Miten tämä kaikki toimi käytännössä? Fabulously, mukaan tutkijatohtorien fellows jotka, kun he aloittivat uusia työpaikkoja ja vasemmalle, wistfully muisteli päivää Stanford.

alkuperäisistä seitsemästä tiedekunnan jäsenestä on jäljellä enää yksi. Vuonna 1959 aistin jännitteitä Arthurin ja Mel Cohnin välillä biologisten ongelmien ratkaisemisesta. Mel puhui innostuneesti Gestaltin biologiasta, näkemyksestä, jonka mukaan biologista ongelmaa ei voi ymmärtää pilkkomalla sitä osiin. Arthur kannatti kemian, erityisesti entsyymien, käyttöä biologisten ongelmien ratkaisemisen perustyökaluna. Vuonna 1962 Mel Cohn lähti Stanfordista vastaperustettuun Salk-instituuttiin, ja vuosina 1963-64 lubert Stryer ja George Stark liittyivät osastoomme. He tekivät pian innovatiivisia kokeiluja, erityisesti kehittivät uusia menetelmiä, jotka herättivät laajaa huomiota. Lubertin kokeet fluoresenssin energiansiirrosta (Stryer and Haugland 1967) johtivat fretin (fluoresenssin resonanssienergiansiirron) kehittämiseen merkittävänä biofysikaalisena työkaluna. George kehitti laajalti käytettyjä menetelmiä transkription ja käännöskokeiden analysointiin paperilla: Pohjoinen menetelmä (Alwine et al. 1977) mrnas: n ja länsimaisen menetelmän (Renart et al. 1979) proteiineille. Vaikka sekä Lubert että George lopulta jättivät osastomme, he säilyttivät läheiset välinsä. Sisään 1971, Ron Davis liittyi department ja, kuten original six tiedekunnan, koskaan lähtenyt Stanford. Ron toi mukanaan elektronimikroskopian DNA: sta, tehokkaan työkalun, jota pian käytettiin laajalti osastolla.

Stanfordin alkuaikojen biokemian osasto oli yhteisö, jossa kaikki jakoivat ja iloitsivat muiden tekemistä löydöistä. Vuonna 1959 koko osasto kokoontui Arthurin kotiin yhtenä iltana kuukaudessa kuuntelemaan erään tutkimusryhmän viimeisimpiä havaintoja. Muutaman vuoden kuluttua emme kaikki mahtuneet Arthurin olohuoneeseen ja yritimme tavata Stanfordin kampuksella sijaitsevassa huoneessa, mutta tunnelma ei ollut sama. Sitten vuonna 1972 aloitimme asilomarissa kaksi kertaa vuodessa muutaman päivän mittaiset kokoukset, joissa kaikki tutkimusryhmät raportoivat. Siihen aikaan jokaisessa kokouksessa oli aina vähintään yksi yllättävä löytö.

vuoteen 1970 mennessä ratkaisut suuriin ongelmiin siitä, miten DNA tekee RNA: sta proteiineja, olivat ainakin pääpiirteittäin selkeitä, ja tiedekuntamme jäsenet olivat siirtymässä uusiin ongelmiin. Arthur oli huomannut, että DNA: n replikaatio on monientsyymiongelma jopa yksinkertaisissa virusjärjestelmissä, ja hän alkoi selvittää DNA: n replikaation yksityiskohtaisia entsymaattisia mekanismeja, ensin fageilla M13 ja φx174, sitten itse kolibakteerilla. Paul Berg ryhtyi tutkimaan eläinviruksia ja joutui pian ongelmiin yhdistelmä-DNA: n kanssa. Bob Lehman alkoi tutkia geneettistä rekombinaatiota DNA-tasolla käyttäen sekä entsymaattisia että geneettisiä työkaluja. Dave Hogness ryhtyi analysoimaan Drosophilan kehitystä DNA-ja mRNA-tasoilla tutkimalla kehitysmutantteja, jotka tekevät hirviöitä ylimääräisillä jaloilla tai siivillä. Dale Kaiser valitsi bakteerin, Myksokokin, tekemään geneettisen analyysin prokaryoottisen järjestelmän kehityksestä. Jopa Arthur testasi kehityksen tutkimista entsymaattisella tasolla käyttämällä bakteeri-itiöitä mahdollisena mallijärjestelmänä. Hänen DNA: n replikointityönsä kuitenkin työnsi itiöt syrjään. Aloin etsiä rakenteellisia välituotteita proteiinin taittoon ja taittomekanismiin.

dramaattinen hetki koitti vuonna 1969, kun John Cairns ilmoitti löytäneensä avustajansa kanssa E. coli-bakteerin elinkelpoisen mutantin, jolta puuttuu DNA-polymeraasi I-entsyymin havaittavissa oleva aktiivisuus (De Lucia and Cairns 1969). Pian seurasi muiden DNA-polymeraasien etsintä. Hämmästyttävää kyllä, se oli Arthurin poika Tom, joka työskenteli Malcolm Gefterin kanssa Columbiassa, joka löysi ensin DNA-polymeraasi II: n ja sitten DNA-polymeraasi III: n, entsyymin, joka kopioi E. coli-kromosomin. Arthur tiivistää tarinan tieteellisessä muistelmateoksessaan (Kornberg 1989a). Tom opiskeli musiikkia Juilliardissa ja hänellä oli edessään lupaava sellistin ura. Cairnsin mutantin tultua julkisuuteen Tom oli saanut käteensä vamman, joka häiritsi hänen sellonsoittoaan. Ilman virallista biokemian koulutusta Tom liittyi Gefterin laboratorioon ja onnistui siinä, missä muilla oli vähän onnea. Toinen dramaattinen hetki koitti vuonna 2006, kun Arthurin vanhin poika Roger sai Nobelin kemianpalkinnon eukaryoottisen transkription molekyylipohjaisesta työstä (Kornberg 2007). Arthurin kolmas poika Ken on arkkitehti, joka tunnetaan tieteellisten laboratorioiden suunnittelijana.

tässä on kaksi esimerkkiä tutkimuksesta, joka lähti nousuun Arthurin politiikan vuoksi sekoittaa tutkimusryhmiä yhteisissä laboratorioissa. Tässä 1968, Immo Scheffler, opiskelija ryhmässäni, joka analysoi DNA helix-kela siirtymiä hiusneula helices, jaettu laboratorio Toto Olivera, tutkijatohtori fellow Bob Lehmanin ryhmä, joka tutki E. coli DNA ligaasi entsymaattisia ominaisuuksia. Toto ja Immo havaitsivat, että ligaasi sulkee d(TA)n-oligoncleotidit yksijuosteisiksi pyöreiksi molekyyleiksi (Olivera et al. 1968) jos ne ovat riittävän suuria (n = 16 tai suurempi). Sitten Immo ja Elliot Elson, jotka työskentelivät Immon kanssa hiusneulan sulamiskäyrien analysoinnissa, huomasivat voivansa käyttää pyöreitä oligonukleotideja, jotka tekevät kaksinkertaisia hiusneulakierteitä, joissa on neljän emäksen silmukka kummassakin päässä, saadakseen yksityiskohtaista tietoa pienten silmukoiden roolista DNA: n sulamisessa (Scheffler et al. 1970). Toinen esimerkki on Doug Vollrath, Ron Davisin ryhmän opiskelija, joka vuonna 1986 jakoi laboratorion Paul Bergin ryhmän tutkijatohtorin Gil Chun kanssa. Gil on suorittanut fysiikan tohtorin tutkinnon Massachusetts Institute of Technologyssa. Doug yritti saada paremmin käsiteltyjä agaroosigeelikuvioita jättimäisille DNA-molekyyleille käyttämällä uutta tekniikkaa, jossa käytetään vaihtosähkökenttää, joka hyödyntää DNA: n uudelleensuuntautumisajan voimakasta riippuvuutta molekyylipainosta. Gil tajusi, että hän voisi käsitellä ongelmaa saada suoria, säännöllisiä DNA-bändejä, jotka ovat hyvin ratkaistu ratkaisemalla yhtälöt perusteoria. Hänen ratkaisunsa vaatii useita elektrodeja, joiden jännitteitä voidaan ohjata yksilöllisesti. Tuloksena oli kauniisti ratkaistu DNA kaistakuviot (Chu et al. 1986).

esimerkkinä siitä, miten entsyymien jakamispolitiikka toimi, Dale Kaiser muistelee Arthurin vuonna 1965 antamaa lahjaa kahdesta puhdistetusta entsyymistä, jotka mahdollistivat Dalen laboratorion tekemän työn Phage lambda-DNA: n koossapitävien päiden parissa (Strack and Kaiser 1965). Nämä kaksi entsyymiä olivat E. coli exo III, joka hajottaa DNA-juostetta 3′ – päästä, ja E. coli DNA Pol I, joka kopioi templaattijuosteen emäsjärjestyksen syntetisoimalla DNA: ta pohjajuosteen 3′ – päästä. Näiden kahden entsyymin korkeat ominaispiirteet ovat tärkeitä tulosten tulkinnassa. Strackilla ja Kaiserilla oli käytettävissä infektiivisyysmääritys, joka mittaa puhdistetun lambda-DNA: n kykyä tuottaa faagia E. coli-bakteerissa, kun siihen lisätään myös inaktiivinen auttajafagi. Tiedettiin, että puhdistetulla lambda-DNA: lla on yhtenäiset paikat (Hershey et al. 1963), jotka toimivat muodostettaessa DNA-dimeerejä ja trimeerejä. Strack ja Kaiser havaitsivat, että sekä EXO III että Pol I inaktivoivat Lambda-DNA: n infektiivisyysmäärityksellä testattuna, ja sisäiset geneettiset markkerit häviävät entsyymikäsittelyn jälkeen yhtä nopeasti kuin ulkoiset markkerit, mikä osoittaa, että kumpikin kahdesta entsyymistä inaktivoi lambda-DNA: n kaikki tai ei mitään-prosessissa. Niiden tulokset sopivat malliin, jossa roikkuvat yksijuosteiset päät työntyvät kaksijuosteisen lambda-DNA: n kumpaankin päähän ja tarjoavat Hersheyn ja työtovereiden (1963) löytämiä yhtenäisiä sivustoja. Exo III hajoaa asteittain 3 ’- päästä, kun taas pol I käyttää roikkuvaa 5 ’- päätä mallina jatkaakseen 3’-päätä, kunnes jäljelle jää vain kaksijuosteinen DNA, joka estää lambda-DNA: ta kiertämästä.

vuonna 1990, 72-vuotiaana, Arthur aloitti uuden tutkimusalan, polyfosfaatin entsymaattisen synteesin ja hajoamisen, johon kuului polyfosfaatin biologisten toimintojen tutkiminen. Arthur ja hänen edesmennyt vaimonsa Sylvy olivat löytäneet E. coli-bakteerin polyfosfaattisynteesin vuonna 1956 (Kornberg et al. 1956). Polyfosfaatti sisältää korkeaenergisiä fosfaattisidoksia ja siitä voidaan valmistaa ATP: tä AMP: stä. Polyfosfaatti on siis bakteerisolujen vara-energian varastointimuoto, ja sillä voidaan olettaa olevan tärkeä rooli bakteerien elinkaaressa. Arthur löysi lukuisia tapauksia, joissa tämä on totta (Kornberg 1999). Erityisesti patogeenisissä bakteereissa polyfosfaatin metaboliaa tarvitaan yleisesti virulenssiin.

Arthur oli ylpeä kaikkien laitoksemme tutkimusryhmien tieteellisistä saavutuksista, ja hän oli henkilökohtaisesti kiinnostunut kaikista läpi menneistä. Monet valmistuneista ovat hyvin tietoisia Arthurin roolista siinä, että laitos on hyvä paikka tehdä tutkimusta. Omalta osaltani tiedän, että Stanfordin ympäristö houkutteli ryhmääni ensiluokkaisia ihmisiä, ja Arthur oli päävastuussa.

kun Arthur kuoli hengitysvajaukseen lokakuussa, hän oli 89-vuotias, ja hän oli ollut sairaana noin viikon. Aiemmin hän johti aktiivisesti polyfosfaatin tutkimusta. Stanfordin biokemian osasto muisti Arthuria 4 tunnin ” teach-inillä.”Opiskelijat ja tiedekunta valitsivat suosikkilehtiä Arthurin 463 julkaisun listalta ja antoivat lyhyitä 5-10 minuutin tiivistelmiä. Arthur olisi pitänyt siitä.

ROBERT L. BALDWIN
Biokemian laitos, Beckman Center, Stanford Medical Center, Stanford, CA

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.